具有更强免疫原性的mRNA疫苗你了解多少？

1 mRNA简介

上个世纪九十年代，在一系列体外转录技术被突破的背景下，mRNA可以作为治疗药物的概念正式被提出来。随后，由于结构简单、安全性好，以及可以诱导机体免疫反应的特点，mRNA技术逐渐被开发为疫苗产品平台。

理论上，mRNA疫苗具有众多传统疫苗不具备的优点。首先，跟传统疫苗相比较mRNA具有更强的免疫原性。mRNA可以表达特定序列的靶蛋白诱导特异性免疫反应，同时作为核酸类的免疫原，mRNA还可以诱导人体的天然免疫反应（见下文），使其拥有“自我佐剂"（self-adjuvant）的特点，两方面的作用，使得疫苗具有更强的免疫原性；第二，在安全性方面，mRNA疫苗的递送不需要特定的质粒载体，不进入细胞核内部，只需要在细胞质内瞬时表达抗原蛋白，不存在整合到人体基因组上的风险。第三，mRNA疫苗具有生产优势。在成本上mRNA疫苗的GMP生产成本是传统疫苗的五到十分之一。另外，由于化学结构相似，生产和纯化与抗原本身无关，同一条mRNA疫苗的生产线很容易被改造成符合EMA或FDA标准的不同抗原疫苗的生产线，因此，在应对突发传染病时，mRNA疫苗很容易在短时间内完成研发和生产。

虽然在理论上mRNA疫苗有着突出的优点，但是目前研发最快的产品还处于临床试验阶段。阻碍mRNA疫苗技术发展的zui大障碍是其对先天性免疫的激活，这种免疫反应对mRNA疫苗来说是一把剑。一方面mRNA通过免疫激活来诱导机体的免疫保护，另一方面过度的激活先天性免疫可以阻止mRNA的翻译，并降解mRNA（见下文）。从成药性的角度来看，一款合格的mRNA疫苗产品要求其mRNA结构足够稳定，能够在靶细胞中递送和表达并诱发预期的适应性免疫反应。

2 mRNA诱导的先天性免疫反应

先天性免疫是人体免疫系统的第一道防线，可以通过模式识别受体（Pattern Recognition Receptor，PRR）识别入侵抗原的病原相关模式分子（Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMP），然后通过一系列复杂的细胞内部级联反应进行免疫应答。mRNA疫苗作为外源的核酸物质，进入体内后会被一系列位于细胞表面、内质网以及细胞质中的模式识别受体识别，并激发机体的先天性免疫应答，正如上文所述，这种免疫应答是一把“剑"。

研究发现，mRNA疫苗诱导的先天性免疫反应可以促进人体树突状细胞（Dendritic cell，DC）的成熟。成熟的DC进一步向人体的免疫系统递呈mRNA表达的靶抗原，诱导机体产生特异的T细胞和B细胞免疫，对人体产生预期的免疫保护效应。从这个角度看，mRNA诱导的先天性免疫反应是有利的。

mRNA疫苗作为一种单链RNA其本身也是一种PRR，其单链结构和代谢产物可以激活细胞内的Toll样受体7（TLR-7）和Toll样受体8（TLR-8），并最终激活I型干扰素介导的先天性免疫反应，最终阻止mRNA表达并降解mRNA。另外，在体外进行mRNA合成的过程中会产生双链RNA（double-strand RNA，dsRNA）。dsRNA也是一种常见的的核酸类PAMP，污染了dsRNA的mRNA产品可以上调并激活蛋白激酶R和寡聚腺苷酸合成酶，随后通过I型干扰素介导的免疫反应阻止mRNA的翻译及降解mRNA。从这个角度来看，mRNA诱导的先天性免疫反应对产品本身有损害作用。这种有害的免疫反应可以通过调节mRNA的核酸序列，在纯化阶段采用先进工艺去除dsRNA等手段避免。

mRNA介导的先天性免疫反应

3 mRNA的结构及优化策略

3.1 mRNA加帽

真核细胞mRNA的5'端有一个帽子结构，它是在mRNA转录后，由甲基化的鸟苷酸（m7G）经焦磷酸化与mRNA的5'端核苷酸相连。5'端帽子结构在mRNA许多生物学功能中起到重要的作用，这包括：mRNA的剪切、稳定、转运和核糖体的募集等。由于5'端帽子结构的重要生物学功能，在mRNA疫苗研发过程中需要优化5'端帽子结构，并利用合适的工艺对mRNA原料进行“加帽"。

mRNA疫苗产品的加帽可以在mRNA的体外转录过程中通过掺入“帽子序列"实现，这种加帽技术会将加帽序列反向加在mRNA上，这会导致约1/3的加帽失败。通过掺入特殊的帽子结构——“anti-reverse"帽子结构（ARCA）可以降低这种反向加帽失误的出现。另外，还可以先合成不带帽子结构的mRNA，再利用痘病毒的“加帽复合物"对mRNA进行加帽，这也是一种mRNA的加帽手段。

3.2 非翻译区序列（UTRs）修饰

在mRNA的编码区两端各存在一段非翻译区（UTRs），在5'端的被称为5'端UTR，在3'端的被称为3'端UTR。

非翻译区序列不是密码子，不能翻译成氨基酸，但是可以通过RNA结合蛋白控制mRNA产品的降解和转录效率。因此，每一种mRNA疫苗都需要考虑如何设计产品的UTR组件，进而提高在目的细胞中mRNA疫苗的稳定性和转录效率。大量的研究发现非洲爪蟾和人源的α-球蛋白/β-球蛋白的UTR序列非常稳定，而且能够增加异源的mRNA的表达效率，因此这两个蛋白的UTR原件通常被设计为mRNA疫苗的UTR组件。当然，也有其它蛋白的UTRs被研究用于mRNA疫苗的组件，在此不再赘述。

3.3 Poly（A）

大多数真核生物的mRNA 的3'端都有由100~200个腺苷酸聚合形成的Poly（A）尾巴。mRNA的Poly（A）尾巴可以和5'端帽子结构共同合作，增强mRNA结构的稳定性。Poly（A）尾巴首先和大量的Poly（A）结合蛋白（PABP）结合，然后募集真核生物起始因子4G（eIF4G），增加Poly（A）跟5'端帽子结构的亲和力，最终mRNA的Poly（A）尾巴和5'端帽子结构首尾相接，形成环装mRNA。环装mRNA结构有利于核糖体的募集，其特殊的结构也能保护mRNA不被降解。

在mRNA体外合成过程中，Poly（A）尾巴可以通过质粒DNA模板转录获得，也可以先合成mRNA再通过Poly（A）聚合酶加上不同单位数量的尾巴。前者能够在mRNA产品中加入特定数目的Poly（A），而后者加入的单位数不确定。

Poly（A）尾巴的单位数目对于其生物学作用起到了至关重要的作用。在哺乳动物细胞内，活跃表达的mRNA包含的Poly（A）序列的长度为100-250个。有研究发现，表达效率越高的mRNA，其Poly（A）尾巴越短。但是当Poly（A）单位长度小于12时，mRNA结构就不再稳定，容易被降解。在设计mRNA疫苗产品的序列时，Poly（A）的长度也是非常重要的优化指标。

3.4 开放阅读框

开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）包涵了mRNA的全部编码序列，负责进入人体后表达mRNA运载的抗原靶蛋白。

密码子水平的修饰，利用常用的密码子，选用tRNA较多的密码子；使各个密码子的比例更接近靶物种或者细胞的比例；

GC含量的修饰，避免复杂二级结构形成；二级结构对mRNA的延伸和转录非常重要，高稳定的二级结构和发夹结构需要避免。这样的二级结构可以阻止核糖体的进入、扫描以及容易被先天性免疫识别为PAMP。

4 mRNA疫苗分类

mRNA疫苗包括两类：自我扩增型（self-amplifying or replicon）以及非复制型（non-replicating or synthetic）的mRNA疫苗。

                    mRNA疫苗的两种类型

自我扩增型mRNA疫苗的设计通常是基于甲病毒属（alphavirus）的病毒基因组。甲病毒属为感染昆虫的RNA病毒，用编码抗原蛋白的mRNA代替甲病毒基因组上的甲病毒结构蛋白RNA，保留了甲病毒基因组自我复制的能力，又不能合成甲病毒蛋白。这类改造后的甲病毒基因组进入体内后可以自我复制产生编码抗原蛋白的mRNA，很少的量就可以引起较强的免疫反应。

非复制型RNA疫苗则是在体外转录好的一段编码抗原蛋白的完整mRNA，包括5ʹ和3ʹ的未翻译区（UTRs），poly A tail用于稳定mRNA和促进转录；同时mRNA还有多种碱基修饰来提高mRNA的稳定性，zui后利用纳米脂质体等递送技术将mRNA递送至细胞内，从而翻译抗原蛋白，引发免疫反应，但是这种合成的mRNA在人体内无法自我复制。

参考文献

DOI：10.1016/j.molmed.2019.10.002

DOI：10.4155/fsoa-2017-0151

DOI：10.1517/14712598.2015.1057563

DOI：org/10.1002/stem.2402

DOI：org/10.4161/rna.22269

DOI：org/10.3389/fimmu.2019.00594

DOI：10.1038/nrd.2017.243

DOI：10.1007/978-1-4939-6481-9

DOI：10.1186/s12967-016-1111-6

DOI：10.1038/s41541-020-0159-8